新型多孔偏磷酸钙复合膜的制备及细胞相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.34.010

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (34): 6123-6130.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.34.010

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新型多孔偏磷酸钙复合膜的制备及细胞相容性

吴岳恒¹，陈鹏²，麦丽萍¹，张灵敏²，汤顺清²，余细勇¹

¹广东省医学科学院广东省心血管病研究所、广东省人民医院医学研究中心，广东省广州市 510100； ²暨南大学生物医学工程研究所，广东省广州市 510632

出版日期:2013-08-20 发布日期:2013-08-20
通讯作者: 余细勇，教授，博士生导师，广东省医学科学院广东省心血管病研究所、广东省人民医院医学研究中心，广东省广州市 510100 yuxycn@hotmail.com
作者简介:吴岳恒，男，1980年生，湖南省株洲市人，汉族，2005年暨南大学毕业，硕士，助理研究员，主要从事心室辅助装置研究，生物材料和组织工程研究。edgar_wu@yahoo.com. cn
基金资助:
国家自然科学基金资助项目（30901468）

Preparation and cytocompatibility of novel porous calcium metaphosphate composite membranes

Wu Yue-heng¹, Chen Peng², Mai Li-ping¹, Zhang Ling-min², Tang Shun-qing², Yu Xi-yong¹

¹Medical Research Center of Guangdong General Hospital, Guangdong Provincial Cardiovascular Institute, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou 510100, Guangdong Province, China; ²Institute of Biomedical Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China

Online:2013-08-20 Published:2013-08-20
Contact: Yu Xi-yong, Professor, Doctoral supervisor, Medical Research Center of Guangdong General Hospital, Guangdong Provincial Cardiovascular Institute, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou 510100, Guangdong Province, China yuxycn@hotmail.com
About author:Wu Yue-heng★, Master, Assistant researcher, Medical Research Center of Guangdong General Hospital, Guangdong Provincial Cardiovascular Institute, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou 510100, Guangdong Province, China edgar_wu@yahoo.com.cn
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30901468

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期研究制备的多孔聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸/偏磷酸钙复合膜厚度较厚，且孔洞不均匀。

目的：制备厚度薄且分布均匀的多孔聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸/偏磷酸钙复合膜，检测其细胞相容性及对细胞分化的作用。\

方法：通过相分离法制备厚度薄且分布均匀的无孔及多孔聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸/偏磷酸钙复合膜，检测其厚度及失重率。将人骨髓间充质干细胞分别与无孔及多孔聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸/偏磷酸钙复合膜共培养7 d，扫描电镜观察复合膜的超微结构，流式细胞术分析复合膜上骨髓间充质干细胞的表面标记物。

结果与结论：多孔和无孔复合膜的厚度分别为(0.041±0.005) mm和(0.058±0.004) mm，24 h失重率分别为19.93%和7.64%。无孔复合膜上的偏磷酸钙粒子分布均匀，细胞完全铺展，呈梭形；多孔复合膜上的偏磷酸钙粒子分布均匀，孔径分布也均匀，孔径2-8 μm，细胞全完铺展，呈多边形，有多个触角，部分细胞触角进入支架内部。无孔与多孔复合膜上的细胞均表达CD105、CD90、CD44、CD29及CD73，组间细胞阳性率差异无显著性意义。实验制备的聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸/偏磷酸钙复合膜具有良好的细胞相容性，但无促细胞分化作用。

关键词: 生物材料, 材料生物相容性, 膜生物材料, 复合膜, 聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸, 偏磷酸钙, 多孔, 人骨髓基质干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Porous poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)/calcium metaphosphate composite membranes prepared previously is too thick and uneven in holes.

OBJECTIVE: To prepare the thin even porous poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)/calcium metaphosphate composite membrane, and to evaluate the cytocompatibility and differentiation capacity.

METHODS: Porous and nonporous, thin and even poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)/calcium metaphosphate composite membranes were prepared by phase separation method. Its thickness and weight loss rate were determined. Human bone marrow mesenchymal stem cells were cocultured with porous and nonporous poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)/calcium metaphosphate composite membranes for 7 days. Ultrastructure of composite membranes was observed under the scanning electron microscopy. Surface markers of the bone marrow mesenchymal stem cells on the composite membranes were analyzed using flow cytometry.

RESULTS AND CONCLUSION:The thickness of the porous and nonporous composite membranes was (0.041 ± 0.005) mm and (0.058±0.004) mm. Weight loss rates of porous and nonporous composite membranes were respectively 19.93% and 7.64% at 24 hours. Calcium metaphosphate particles were evenly distributed in porous and nonporous composite membrane. Cells spread entirely, showing spindle shape. Calcium metaphosphate particles were evenly distributed in porous composite membrane. Pore in porous composite membranes was also uniformly distributed, and pore size was about 2-8 μm. Cells spread entirely, showing polygonal shape with multiple tentacles. The tentacles of some cells entered into the scaffold. CD105, CD90, CD44, CD29 and CD73 expression was detected in porous and nonporous composite membranes. There was no significant difference in cell-positive rate. Poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)/calcium metaphosphate composite membranes prepared in this study has good biocompatibility and could not promote cell differentiation.

Key words: biomaterials, material biocompatibility, membrane biomaterial, composite membranes, poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate, calcium metaphosphate, porous, human bone marrow stromal stem cells, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318

吴岳恒，陈鹏，麦丽萍，张灵敏，汤顺清，余细勇. 新型多孔偏磷酸钙复合膜的制备及细胞相容性[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(34): 6123-6130.

Wu Yue-heng, Chen Peng, Mai Li-ping, Zhang Ling-min, Tang Shun-qing, Yu Xi-yong. Preparation and cytocompatibility of novel porous calcium metaphosphate composite membranes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(34): 6123-6130.

图/表（结果） 4

2.1 P(3HB-co-4HB)/偏磷酸钙复合膜厚度和失重率 经测量，多孔复合膜厚度为(0.041±0.005) mm，无孔复合膜厚度为(0.058±0.004) mm。由图1可知，多孔复合膜的24 h失重率为19.93%，无孔复合膜的24 h失重率为7.64%。

2.2 扫描电子显微镜观察P(3HB-co-4HB)/偏磷酸钙复合膜细胞培养后的超微结构 图2A，B是无孔P(3HB-co-4HB)/偏磷酸钙复合膜表面人骨髓间充质干细胞培养7 d后的材料和细胞表面形貌。无孔膜上偏磷酸钙分布较均匀，人骨髓间充质干细胞完全铺展，基本呈梭形，细胞通常与偏磷酸钙粒子有一定接触；图2C，D是多孔P(3HB-co-4HB)/偏磷酸钙复合膜与细胞培养后材料和细胞的表面形貌。

多孔膜孔径2-8 μm，由于多孔表面和偏磷酸钙粒子的存在，人骨髓间充质干细胞完全铺展，但基本呈多边形，有多个触角，有些触角与偏磷酸钙粒子接触，有些触角与多孔边界相连，可见部份细胞触角进入多孔支架另侧，有一定的三维生长方式。
2.3 流式细胞仪初步检验复合膜对人骨髓间充质干细胞的影响见图3-6。

图3和图4流式细胞术检测结果，图5和图6是所测结果的分析。图5是细胞表面标记CD105、CD90、CD44、CD29 和CD73的表达均为阳性表达。对图5的数据进行方差分析发现，所有上述细胞表面标记在正常对照组、多孔复合膜组和无孔复合膜组间比较差异无显著性意义。图6是CD117、CD34、CD45和CD184等细胞表面标记的表达均为阴性表达。对图6的数据进行方差分析发现，CD117和CD34细胞表面标记在正常对照组、多孔复合膜组和无孔复合膜组间比较差异无显著性意义。CD45和 CD184细胞表面标记在正常对照组、多孔复合膜组和无孔复合膜组间比较差异有显著性意义(P ≤ 0.01)。进一步分析CD45、CD184上述3组之间的差异情况，分别对CD45、CD184上述3组之间采用S-N-K检验进行两两比较，结果发现，多孔复合膜组与正常对照组、无孔复合膜组之间比较差异有显著性意义(P ≤ 0.01)，正常对照组和无孔复合膜组之间比较差异无显著性意义。总之，CD105、CD90、CD44、CD29、CD73、CD117和CD34细胞表面标记在正常对照组、多孔复合膜组和无孔复合膜组间比较差异无显著性意义。多孔复合膜组CD45和CD184表达与正常对照组、无孔复合膜组之间比较差异有显著性意义(P ≤ 0.01)，正常对照组和无孔复合膜组之间比较差异无显著性意义。

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引言

心瓣膜疾病是危害人类健康的常见疾病之一，目前所用的机械瓣和生物瓣均存在一定的缺点，探索和研究一种理想的人造心脏瓣膜，是心脏瓣膜外科领域所要解决的重大问题。随着组织工程技术的发展，组织工程心脏瓣膜被认为是一种潜在的理想的人造瓣膜，其主要研究问题是生物相容性和耐久性，如避免血栓栓塞、钙化等^[1]，组织工程瓣膜的构建主要通过支架材料、种子细胞和微环境等因素调节^[2]。干细胞是人体内一种有潜力能够分化为其他类型细胞的细胞。干细胞的干性维持，也称自我更新能力，是指细胞分裂后能产生与自身完全相同的子代细胞，由多种信号通路形成的网络共同调控，如Wnt和Notch信号通路等^[3-5]。现有观点认为，支架材料作为一种特殊的微环境，在干细胞干性维持和促分化领域有重要的意义^[5-9]。将干细胞种植在多孔支架材料表面是构建组织工程瓣膜及补片的常用方法^[10]，常用的干细胞有内皮袓细胞^[11]、人骨髓间充质干细胞^[12]、脂肪来源干细胞^[2]、胚胎干细胞^[13]、心脏基质干细胞^[14]、人牙周膜细胞^[15]。如有人将内皮袓细胞种植在脱细胞并经过表面改性的脱细胞牛主动脉瓣表面，显著改善了人红细胞与组织工程瓣膜的黏附，防止了血栓形成，提示支架材料的性能在组织工程瓣膜构建中有重要意义^[11]。人骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中具有高度自我更新和多向分化潜能的干细胞群体，是近年来干细胞研究领域的一个热点，在临床具有广阔的应用前景^[12]。有人将人骨髓间充质干细胞种植在聚乳酸/聚乙醇酸无纺布材料上，所制备的组织工程瓣膜在机械性能上同生物瓣相近，正在进行动物学实验^[16]。也有人将人骨髓间充质干细胞种植在血小板凝胶附着的或表面改性的脱细胞牛主动脉瓣表面，证明其有利于组织工程瓣膜构建，防止血栓形成等^[17-18]。组织工程支架材料是根据材料用于不同人体组织，并根据具体替代组织具备的功能所设计的，而选择何种支架材料是经常困扰研究者的难题。现有支架材料包括天然支架材料、合成可降解高分子材料及其复合材料。天然支架材料生物相容性和三维空间构象较好^[17-18]，合成可降解高分子材料具有良好的可控性和力学性能^[16^，^19]，构建复合支架材料的设计目的为取长补短，有一定的优势^[11]。总之，现有研究已开发出多种应用于瓣膜及补片的组织工程支架材料，但均有一定的应用局限性，并没有完全筛选出合适的支架材料，尤其是支架材料作为微环境对干细胞的调控作用尚未深入研究。聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸[poly(3- hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)，P(3HB-co- 4HB)]共聚酯和偏磷酸钙具有优良的生物降解性和生物相容性^[20-21]，同时可通过调节4-羟基丁酸单元的含量可改善P(3HB-co-4HB) 共聚酯的脆性和加工性^[22]，也可通过调节β-Ca₂P₂O₆的结晶度而改善材料降解性能^[23]，作为组织工程瓣膜研究有一定优势。吴岳恒等^[24-26]将P(3HB-co-4HB)与偏磷酸钙复合，成功制备了一种多孔P(3HB-co-4HB)/偏磷酸钙复合膜，并初步获得其降解规律，认为这种复合膜可应用于组织工程瓣膜及补片的研究，所获得的复合膜孔隙率达46.3%，但复合膜厚且不均匀，其作为微环境调节因素对干细胞的调控作用亦未明确。实验拟通过改变制备工艺获得厚度薄、孔洞分布均匀的P(3HB-co-4HB)/偏磷酸钙复合膜，观察多孔P(3HB-co-4HB)/偏磷酸钙复合膜对骨髓间充质干细胞促分化的影响。

材料方法

设计：生物相容性材料的制备，对比观察实验。

时间及地点：于2012年3至5月在广东省人民医院医学研究中心和暨南大学生物医学工程所完成。

材料：偏磷酸钙玻璃陶瓷在暨南大学生物医学工程研究所制备，其配方和制备方法见文献[24]。P(3HB-co-4HB)购自山东省意可曼科技有限公司，型号为EM5500F(含4-羟基丁酸15%)。基于离心泵的循环装置及反应器由广东省人民医院医学研究中心制备及提供，具体参数性能见文献[25]。

新型多孔偏磷酸钙复合膜的制备及细胞相容性实验的主要试剂及仪器：

实验方法：

偏磷酸钙微粒的制备：将所制备的偏磷酸钙玻璃陶瓷置于XQM行星球磨仪中球磨48 h。取球磨后的微粒，过200目筛，无水乙醇5次洗涤，干燥备用。

无孔及多孔P(3HB-co-4HB)/偏磷酸钙复合膜的制备：原料比设 (P(3HB-co-4HB)/偏磷酸钙)质量比为50∶50，混合均匀，完全溶解于氯仿后，移取100 µL混和液滴加在正在旋转的旋转涂膜仪中的载玻片表面，转速为 2 000 r/min，氯仿挥发后即成P(3HB-co-4HB)/偏磷酸钙多孔复合膜；转速为200 r/min，即得无孔复合膜。

P(3HB-co-4HB)/偏磷酸钙复合膜厚度及失重率的检测：分别取无孔膜和多孔膜各5块，采用游标卡尺测其厚度，计算其厚度；分别取无孔膜和多孔膜各5块，分析天平测定其重量后，将其置于循环装置中，流速为0.30 m/s，管路内灌满37 ℃生理盐水50 mL。运行循环装置2，4，8，16，24 h后，停循环，分别小心取样品后于120 ℃烘干至恒质量，分析天平称质量，求其不同时间点的失重率。

人骨髓间充质干细胞的制备：经患者知情同意，于骨折患者健康椎体取得骨髓2 mL，接种于25 cm²培养瓶，以成人骨髓间质干细胞完全培养基培养48 h换液，以后隔天换液；待细胞生长至约80%融合后胰蛋白酶消化传代。倒置显微镜下观察细胞生长状态；流式细胞术检测细胞表面标记。

P(3HB-co-4HB)/偏磷酸钙复合膜的细胞培养实验：将第3代人骨髓间充质干细胞制成适量高浓度细胞悬液，含细胞(1.0-1.5)×10⁵，直接滴加在无孔及多孔复合膜材料表面，CO₂培养箱培养2.0-3.0 h，使细胞黏附于材料上，再加满培养液1.0-2.0 mL，没过整个复合膜。每2 d换液1次，共培养7 d。

扫描电子显微镜观察P(3HB-co-4HB)/偏磷酸钙复合膜的超微结构：分别取与人骨髓间充质干细胞共培养7 d的无孔膜和多孔膜，固定、干燥、贴于铜台表面，在Quanta 400扫描电子显微镜下观察其表面形貌。

流式细胞术检测细胞表面标记：将需分析的人骨髓间充质干细胞及与复合膜共培养7 d后的人骨髓间充质干细胞制成单细胞悬液。同型对照中加入荧光素标志的同型对照抗体作为阴性对照，待测管中分别加入鼠抗人单克隆抗体CD105、CD90、CD117、CD73、CD45、CD29、CD44、CD34和CD184各5 μL，室温孵育20 min(部分参考说明书)，孵育结束后，1 200 r/min离心5 min，离心半径15 cm，弃上清，PBS洗涤1次后，1 200 r/min离心5 min，离心半径15 cm，弃上清，PBS定容至 200 μL，混匀，上机测定。

主要观察指标：多孔P(3HB-co-4HB)/偏磷酸钙复合膜的厚度和失重率；多孔及无孔P(3HB-co-4HB)/偏磷酸钙复合膜上人骨髓间充质干细胞的表面形貌；多孔及无孔P(3HB-co-4HB)/偏磷酸钙复合膜上人骨髓间充质干细胞表面标记物CD105、CD90、CD117、CD73、CD45、CD29、CD44、CD34及CD184的表达。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件处理数据，空白、多孔和无孔组人骨髓间充质干细胞上的表面标记物的表达差异采用方差分析，空白、多孔和无孔组之间采用S-N-K检验进行两两比较。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

3.1 样品制备 组织工程瓣膜及补片需满足以下几个要求：生物相容性好、降解速率适度、厚度薄且分布均匀、多孔且孔洞分布均匀等。制备多孔膜的方法主要有电纺丝法、溶液浇铸法、相分离法、盐析法、激光打孔法和相转变法等，但其所制备的多孔膜性能不一样，有些孔洞连续，有些孔隙率较小。组织工程所需要的孔洞通常较均匀和丰富，故常采用电纺丝法和相分离法制备多孔膜^[27-28]。如有人专门研究了这两种方法在制备多孔材料上的异同，并观察两种成孔方式对心肌细胞的影响，结果显示，两种材料宏观上差异不明显，在形态上前者细胞多边形明显，后者细胞较规则，在分泌胶原和连接蛋白方面两者也有显著差异^[29] 。实验采用相分离方法制备多孔膜，具体通过旋转涂膜仪来制膜。本多孔膜的成孔原理即氯仿与P(3HB-co-4HB)的相分离^[28] 。由厚度数据可知，所制备多孔膜的厚度薄于无孔膜，这可能是因为旋转涂膜的过程中，多孔膜的离心速度较快，氯仿与P(3HB-co-4HB)构成的高分子溶液流动性更强。原有实验方法也可制备多孔P(3HB-co-4HB)/偏磷酸钙复合膜，但因为制备工艺简单，可重复性较差^[28] 。实验结果证明，通过固定实验工艺可制备厚度薄且均匀的多孔和非多孔复合膜。
3.2 样品降解性能 降解及在降解过程中伴随的机械性能的变化是瓣膜组织工程支架材料至为重要的两个特性。组织工程瓣膜的耐久性是当前研究的难点，由于组织工程瓣膜需应用在复杂的流场环境，故实验主要考察在复杂流场下，所选支架材料的降解性能。但实验所设计的流场为恒流，而非组织工程瓣膜所需求的脉动流，还可继续改进。实验所选的P(3HB-co-4HB)支架材料降解速度较慢，断裂伸长率较高，有较好的机械性能，而偏磷酸钙降解较快，机械性能较差。本课题组前期研究降解结果也显示，原来所制备的多孔P(3HB-co-4HB)/偏磷酸钙复合膜体外降解较慢，24 h流场下复合膜失重率为10.6%^[28] 。由图１可知，新工艺所制备的多孔P(3HB-co- 4HB)/偏磷酸钙复合膜失重率达19.9%。复合膜降解的机制可能是：当流体冲刷复合膜表面后，表面复合不牢固和比较浅的偏磷酸钙快速优先降解；当流体冲刷复合膜表面时间后，P(3HB-co-4HB)表面降解变薄，许多偏磷酸钙粒子暴露在流体当中再降解，这可能是该复合材料降解先快后慢的原因；多孔膜的表面积明显大于非多孔膜，故其降解速率也大于非多孔膜。
3.3 样品形貌观察 因为所制备的复合膜非常薄，难以通过水重力法测其孔隙率，故实验通过扫描电镜观察其成孔性能。通过观察两种膜的扫描电镜表面形貌，证实通过新工艺可获得孔洞较均匀，重复性好的多孔P(3HB-co-4HB)/偏磷酸钙复合膜，如多孔膜孔径2-8 μm，非多孔膜上偏磷酸钙分布较均匀等。扫描电镜观察结果提示，多孔膜的细胞表面形貌与非多孔膜的细胞形貌有明显的差异，这有可能会在一定程度上影响人骨髓间充质干细胞的功能。
3.4 流式细胞检测 人骨髓间充质干细胞是一类非造血干细胞，具有自我更新能力和多向分化潜能。目前，人骨髓间充质干细胞在增殖过程中主要存在增殖潜力和多向分化潜力逐渐丧失的问题，尤其对微环境敏感，极易发生自分化现象，而人血清、生长因子、细胞外基质培养基、生物反应器和中药等微环境调节逐渐成为此类研究的热点^[30-31] 。在组织工程领域，支架材料作为微环境调节机制的重要性越来越得到认可^{[32-33 ]}。如有人大规模研究了天然材料、高分子材料分别在二维和三维状态下对胚胎干细胞的影响，结果显示，支架材料在分化、增殖和迁移等多方面对胚胎干细胞均有显著影响^[34] 。因此，设计合适的支架材料作为人骨髓间充质干细胞的分化、非分化和定向分化增殖微环境是当今研究的热点。偏磷酸钙的主要成分是钙和磷元素，同时含有钙和磷的生物材料主要有磷酸三钙、羟基磷灰石等。这此生物材料通常不能降解或降解比较慢，与人体骨组织的主要成份相似，故常被用做组织工程骨。有观点认为含钙磷较多的无机材料分均易诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化^[35-36] ，本课题组前期研究发现，人骨髓间充质干细胞能在偏磷酸钙表面生长及增殖，没有发现其有明显的定向成骨能力。实验中多孔复合膜组、无孔复合膜组与正常对照组的多个表面标记(CD105、CD90、CD44、CD29、CD73、CD117和CD34)表达差异无显著性意义。这说明偏磷酸钙在此浓度下，复合膜对人骨髓间充质干细胞无诱导能力，不会促使其向其他细胞分化^[37] 。此外，CD184是趋化因子受体CXCR4的抗体。目前研究发现干细胞趋化因子及其受体CXCR4对干细胞动员、迁移、细胞归巢起到重要作用^[38-39] ，故可认为CD184的高表达有利于人骨髓间充质干细胞迁移能力的增加，这可能是因为复合膜多孔有利于细胞迁移。CD45分子在所有白细胞上都有表达，称为白细胞共同抗原^[40] ，在淋巴细胞的发育成熟，功能调节及信号传递中具有重要意义。实验中多孔复合膜组的CD45表达高于无孔复合膜组和正常对照组暂时还无法解释^[41] 。这些结果证明了此支架材料可以在一定程度上调节部分细胞表面受体的表达，提示此复合膜在构建人骨髓间充质干细胞的非分化增殖微环境中可起到一定的作用。综上分析可以知道：通过改良工艺可以制备厚度薄、孔洞分布均匀的P(3HB-co-4HB)/偏磷酸钙复合膜；通过形貌观察，发现非多孔复合膜偏磷酸钙粒子分布均匀，多孔复合膜除偏磷酸钙粒子分布均匀外，孔径分布也均匀；流式细胞结果证明复合膜对人骨髓间充质干细胞无诱导能力，不会促使其向其他细胞分化；有2个细胞表面标记的表达差异有显著性意义，证明此复合膜在可以在一定程度上调节细胞表面受体的表达。

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人骨髓间充质干细胞是一类非造血干细胞，具有自我更新能力和多向分化潜能。目前，人骨髓间充质干细胞在增殖过程中主要存在增殖潜力和多向分化潜力逐渐丧失的问题，尤其对微环境敏感，极易发生自分化现象，而人血清、生长因子、细胞外基质培养基、生物反应器和中药等微环境调节逐渐成为此类研究的热点。在组织工程领域，支架材料作为微环境调节机制的重要性越来越得到认可。如有人大规模的研究了天然材料，高分子材料分别有二维和三维状态下对胚胎干细胞的影响，结果显示，支架材料在分化、增殖和迁移等多方面对胚胎干细胞均有显著影响。因此，设计合适的支架材料作为人骨髓间充质干细胞的分化、非分化和定向分化增殖微环境是当今研究的热点。

偏磷酸钙的主要成分是钙和磷元素，同时含有钙和磷的生物材料主要有磷酸三钙、羟基磷灰石等。这此生物材料通常不能降解或降解比较慢，与人体骨组织的主要成份相似，故常被用做组织工程骨。有观点认为：含钙磷较多的无机材料分均易诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化，本课题组前期研究发现，人骨髓间充质干细胞能在偏磷酸钙表面生长及增殖，没有发现其有明显的定向成骨能力。实验中多孔复合膜组、无孔复合膜组与正常对照组的多个表面标记（CD105、CD90、CD44、CD29、CD73、CD117和CD34）表达差异无显著性意义。这说明偏磷酸钙在此浓度下，复合膜对人骨髓间充质干细胞无诱导能力，不会促使其向其他细胞分化。此外，CD184是趋化因子受体CXCR4的抗体。目前研究发现干细胞趋化因子及其受体CXCR4对干细胞动员、迁移、细胞归巢起到重要作用，故可认为CD184的高表达有利于人骨髓间充质干细胞的迁移能力的增加，这可能是因为复合膜多孔有利于细胞迁移。CD45分子在所有白细胞上都有表达，称为白细胞共同抗原，在淋巴细胞的发育成熟，功能调节及信号传递中具有重要意义。实验中多孔复合膜组的CD45表达高于无孔复合膜组和正常对照组暂时还无法解释。这些结果证明了此支架材料可以在一定程度上调节部分细胞表面受体的表达，提示此复合膜在构建人骨髓间充质干细胞的非分化增殖微环境中可起到一定的作用。

新型多孔偏磷酸钙复合膜的制备及细胞相容性

Preparation and cytocompatibility of novel porous calcium metaphosphate composite membranes

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